પીસીઆર પ્રતિક્રિયાઓમાં દખલના પરિબળો

પીસીઆર પ્રતિક્રિયા દરમિયાન, કેટલાક દખલકારી પરિબળોનો વારંવાર સામનો કરવો પડે છે.
PCR ની ખૂબ જ ઊંચી સંવેદનશીલતાને લીધે, PCR પરિણામોને અસર કરતા દૂષણ એ સૌથી મહત્વપૂર્ણ પરિબળોમાંનું એક માનવામાં આવે છે અને તે ખોટા હકારાત્મક પરિણામો લાવી શકે છે.
ખોટા-નકારાત્મક પરિણામો તરફ દોરી જતા વિવિધ સ્ત્રોતો પણ એટલા જ મહત્વપૂર્ણ છે. જો પીસીઆર મિશ્રણના એક અથવા વધુ આવશ્યક ભાગો અથવા એમ્પ્લીફિકેશન પ્રતિક્રિયા પોતે જ અવરોધે છે અથવા તેની સાથે દખલ કરે છે, તો નિદાનની તપાસમાં અવરોધ આવી શકે છે. આનાથી કાર્યક્ષમતા ઘટી શકે છે અને ખોટા નકારાત્મક પરિણામો પણ આવી શકે છે.
નિષેધ ઉપરાંત, નમૂનાની તૈયારી પહેલા શિપિંગ અને/અથવા સ્ટોરેજની સ્થિતિને કારણે લક્ષ્ય ન્યુક્લિક એસિડ અખંડિતતાનું નુકસાન થઈ શકે છે. ખાસ કરીને, ઉચ્ચ તાપમાન અથવા અપૂરતું સંગ્રહ કોષો અને ન્યુક્લીક એસિડને નુકસાન પહોંચાડી શકે છે. સેલ અને ટીશ્યુ ફિક્સેશન અને પેરાફિન એમ્બેડિંગ ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટેશન અને સતત સમસ્યાના જાણીતા કારણો છે (જુઓ આકૃતિ 1 અને 2). આ કિસ્સાઓમાં, શ્રેષ્ઠ અલગતા અને શુદ્ધિકરણ પણ મદદ કરશે નહીં.

આકૃતિ 1 | ડીએનએ અખંડિતતા પર સ્થિરતાની અસર
એગેરોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ દર્શાવે છે કે શબપરીક્ષણના પેરાફિન વિભાગોમાંથી અલગ કરાયેલ ડીએનએની ગુણવત્તા નોંધપાત્ર રીતે બદલાય છે. ફિક્સેશન પદ્ધતિના આધારે અર્કમાં વિવિધ સરેરાશ ટુકડાઓની લંબાઈના ડીએનએ હાજર હતા. જ્યારે મૂળ સ્થિર નમૂનાઓમાં અને બફર ન્યુટ્રલ ફોર્મેલિનમાં નિશ્ચિત કરવામાં આવે ત્યારે જ ડીએનએ સાચવવામાં આવતું હતું. મજબૂત એસિડિક બોઈન ફિક્સેટિવ અથવા અનબફર્ડ, ફોર્મિક એસિડ ધરાવતું ફોર્મેલિનના ઉપયોગથી ડીએનએનું નોંધપાત્ર નુકસાન થયું. બાકીનો અપૂર્ણાંક અત્યંત ખંડિત છે.
ડાબી બાજુએ, ટુકડાઓની લંબાઈ કિલોબેઝ જોડીઓ (kbp) માં દર્શાવવામાં આવે છે.

આકૃતિ 2 | ન્યુક્લિક એસિડ લક્ષ્યોની અખંડિતતાની ખોટ
(a) બંને સેર પર 3′-5′ ગેપ લક્ષ્ય DNA માં વિરામ તરફ દોરી જશે. ડીએનએનું સંશ્લેષણ હજુ પણ નાના ટુકડા પર થશે. જો કે, જો ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટ પર પ્રાઈમર એન્નીલિંગ સાઇટ ખૂટે છે, તો માત્ર રેખીય એમ્પ્લીફિકેશન થાય છે. સૌથી સાનુકૂળ કિસ્સામાં, ટુકડાઓ એકબીજાને પુનઃસંતૃપ્ત કરી શકે છે, પરંતુ ઉપજ નાની અને શોધ સ્તરથી ઓછી હશે.
(b) પાયાની ખોટ, મુખ્યત્વે ડિપ્યુરીનેશન અને થાઈમિડિન ડાઇમરની રચનાને કારણે, H-બોન્ડની સંખ્યામાં ઘટાડો અને Tm માં ઘટાડો તરફ દોરી જાય છે. વિસ્તરેલ વોર્મિંગ તબક્કા દરમિયાન, પ્રાઇમર્સ મેટ્રિક્સ ડીએનએથી દૂર ઓગળી જશે અને ઓછી કડક પરિસ્થિતિઓમાં પણ એનિલ થશે નહીં.
(c) અડીને આવેલા થાઇમિન પાયા TT ડાઇમર બનાવે છે.
બીજી સામાન્ય સમસ્યા જે મોલેક્યુલર ડાયગ્નોસ્ટિક્સમાં વારંવાર જોવા મળે છે તે છે ફિનોલ-ક્લોરોફોર્મ નિષ્કર્ષણની તુલનામાં લક્ષ્ય ન્યુક્લીક એસિડ્સનું ઓછા-ઓછા પ્રમાણમાં પ્રકાશન. આત્યંતિક કિસ્સાઓમાં, આ ખોટા નકારાત્મક સાથે સંકળાયેલ હોઈ શકે છે. સેલ કચરાના ઉકળતા લિસિસ અથવા એન્ઝાઇમેટિક પાચન દ્વારા ઘણો સમય બચાવી શકાય છે, પરંતુ આ પદ્ધતિ ઘણીવાર ન્યુક્લિક એસિડના અપૂરતા પ્રકાશનને કારણે ઓછી પીસીઆર સંવેદનશીલતામાં પરિણમે છે.

એમ્પ્લીફિકેશન દરમિયાન પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિનો અવરોધ

સામાન્ય રીતે, નિષેધનો ઉપયોગ તમામ પરિબળોને વર્ણવવા માટે કન્ટેનર ખ્યાલ તરીકે થાય છે જે સબઓપ્ટીમલ પીસીઆર પરિણામો તરફ દોરી જાય છે. સખત બાયોકેમિકલ અર્થમાં, નિષેધ એ એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિ સુધી મર્યાદિત છે, એટલે કે, તે DNA પોલિમરેઝ અથવા તેના કોફેક્ટરની સક્રિય સાઇટ (દા.ત., Taq DNA પોલિમરેઝ માટે Mg2+) સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા સબસ્ટ્રેટ-પ્રોડક્ટના રૂપાંતરને ઘટાડે છે અથવા અટકાવે છે.
નમૂનામાંના ઘટકો અથવા રીએજન્ટ ધરાવતા વિવિધ બફર અને અર્ક એન્ઝાઇમને સીધો અટકાવી શકે છે અથવા તેના કોફેક્ટર્સ (દા.ત. EDTA) ને ફસાવી શકે છે, ત્યાં પોલિમરેઝને નિષ્ક્રિય કરી શકે છે અને બદલામાં ઘટાડો અથવા ખોટા નકારાત્મક PCR પરિણામો તરફ દોરી જાય છે.
જો કે, પ્રતિક્રિયા ઘટકો અને લક્ષ્ય-સમાવતી ન્યુક્લીક એસિડ્સ વચ્ચેની ઘણી ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને પણ 'PCR અવરોધકો' તરીકે નિયુક્ત કરવામાં આવે છે. એકવાર કોષની અખંડિતતા અલગતા દ્વારા વિક્ષેપિત થઈ જાય અને ન્યુક્લીક એસિડ મુક્ત થઈ જાય, ત્યારે નમૂના અને તેની આસપાસના ઉકેલ અને નક્કર તબક્કા વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા થઈ શકે છે. ઉદાહરણ તરીકે, 'સ્કેવેન્જર્સ' બિન-સહસંયોજક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દ્વારા સિંગલ- અથવા ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએને બાંધી શકે છે અને પીસીઆર પ્રતિક્રિયા જહાજ સુધી પહોંચતા લક્ષ્યોની સંખ્યાને ઘટાડીને અલગતા અને શુદ્ધિકરણમાં દખલ કરી શકે છે.
સામાન્ય રીતે, પીસીઆર અવરોધકો ક્લિનિકલ ડાયગ્નોસ્ટિક પરીક્ષણો (પેશાબમાં યુરિયા, હિમોગ્લોબિન અને લોહીમાં હેપરિન), આહાર પૂરવણીઓ (કાર્બનિક ઘટકો, ગ્લાયકોજેન, ચરબી, Ca2+ આયનો) અને પર્યાવરણમાં ઘટકો (ફિનોલ્સ) માટે ઉપયોગમાં લેવાતા મોટાભાગના શરીરના પ્રવાહી અને રીએજન્ટ્સમાં હાજર હોય છે. , ભારે ધાતુઓ)

વધુ પ્રચલિત પીસીઆર અવરોધકો બેક્ટેરિયા અને યુકેરીયોટિક કોષો, બિન-લક્ષ્ય ડીએનએ, ટીશ્યુ મેટ્રિસીસના ડીએનએ-બંધનકર્તા મેક્રોમોલેક્યુલ્સ અને મોજા અને પ્લાસ્ટિક જેવા પ્રયોગશાળાના સાધનોમાં મળી શકે છે. નિષ્કર્ષણ દરમિયાન અથવા પછી ન્યુક્લિક એસિડનું શુદ્ધિકરણ એ પીસીઆર અવરોધકોને દૂર કરવા માટેની પસંદગીની પદ્ધતિ છે.
આજે, વિવિધ સ્વચાલિત નિષ્કર્ષણ સાધનો ઘણા મેન્યુઅલ પ્રોટોકોલને બદલી શકે છે, પરંતુ 100% પુનઃપ્રાપ્તિ અને/અથવા લક્ષ્યોનું શુદ્ધિકરણ ક્યારેય પ્રાપ્ત થયું નથી. સંભવિત અવરોધકો હજી પણ શુદ્ધ ન્યુક્લીક એસિડમાં હાજર હોઈ શકે છે અથવા તે પહેલાથી જ અસર કરી શકે છે. અવરોધકોની અસર ઘટાડવા માટે વિવિધ વ્યૂહરચનાઓ અસ્તિત્વમાં છે. યોગ્ય પોલિમરેઝની પસંદગી અવરોધક પ્રવૃત્તિ પર નોંધપાત્ર અસર કરી શકે છે. PCR નિષેધને ઘટાડવા માટેની અન્ય સાબિત પદ્ધતિઓ પોલિમરેઝ સાંદ્રતામાં વધારો અથવા BSA જેવા ઉમેરણોનો ઉપયોગ કરી રહી છે.
પીસીઆર પ્રતિક્રિયાઓના નિષેધને આંતરિક પ્રક્રિયા ગુણવત્તા નિયંત્રણ (આઈપીસી) ના ઉપયોગ દ્વારા દર્શાવી શકાય છે.
નિષ્કર્ષણ કીટમાંના તમામ રીએજન્ટ્સ અને અન્ય સોલ્યુશન્સ, જેમ કે ઇથેનોલ, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, આઇસોપ્રોપાનોલ અને ફિનોલને ન્યુક્લીક એસિડમાંથી સંપૂર્ણપણે ધોવાના પગલા દ્વારા અલગ કરવા માટે કાળજી લેવી આવશ્યક છે. તેમની એકાગ્રતા પર આધાર રાખીને, તેઓ પીસીઆરને સક્રિય અથવા અટકાવી શકે છે.