પીસીઆર પ્રતિક્રિયાઓમાં દખલ પરિબળો

પીસીઆર પ્રતિક્રિયા દરમિયાન, કેટલાક દખલ કરનારા પરિબળોનો વારંવાર સામનો કરવો પડે છે.
પીસીઆરની ખૂબ જ ઊંચી સંવેદનશીલતાને કારણે, દૂષણને પીસીઆર પરિણામોને અસર કરતા સૌથી મહત્વપૂર્ણ પરિબળોમાંનું એક માનવામાં આવે છે અને તે ખોટા હકારાત્મક પરિણામો આપી શકે છે.
ખોટા-નકારાત્મક પરિણામો તરફ દોરી જતા વિવિધ સ્ત્રોતો પણ એટલા જ મહત્વપૂર્ણ છે. જો PCR મિશ્રણના એક અથવા વધુ આવશ્યક ભાગો અથવા એમ્પ્લીફિકેશન પ્રતિક્રિયાને અટકાવવામાં આવે અથવા તેમાં દખલ કરવામાં આવે, તો ડાયગ્નોસ્ટિક પરીક્ષણ અવરોધિત થઈ શકે છે. આનાથી કાર્યક્ષમતામાં ઘટાડો થઈ શકે છે અને ખોટા નકારાત્મક પરિણામો પણ આવી શકે છે.
નિષેધ ઉપરાંત, નમૂના તૈયાર કરતા પહેલા શિપિંગ અને/અથવા સંગ્રહની સ્થિતિને કારણે લક્ષ્ય ન્યુક્લિક એસિડની અખંડિતતાનું નુકસાન થઈ શકે છે. ખાસ કરીને, ઉચ્ચ તાપમાન અથવા અપૂરતી સંગ્રહ કોષો અને ન્યુક્લિક એસિડને નુકસાન પહોંચાડી શકે છે. કોષ અને પેશીઓનું ફિક્સેશન અને પેરાફિન એમ્બેડિંગ એ ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટેશન અને સતત સમસ્યાના જાણીતા કારણો છે (આકૃતિઓ 1 અને 2 જુઓ). આ કિસ્સાઓમાં, શ્રેષ્ઠ અલગતા અને શુદ્ધિકરણ પણ મદદ કરશે નહીં.

આકૃતિ 1 | ડીએનએ અખંડિતતા પર સ્થિરતાની અસર
એગારોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ દર્શાવે છે કે શબપરીક્ષણના પેરાફિન વિભાગોમાંથી અલગ કરાયેલા ડીએનએની ગુણવત્તામાં નોંધપાત્ર ફેરફાર થયો હતો. ફિક્સેશન પદ્ધતિના આધારે અર્કમાં વિવિધ સરેરાશ ટુકડાઓની લંબાઈના ડીએનએ હાજર હતા. ડીએનએ ફક્ત મૂળ સ્થિર નમૂનાઓમાં અને બફર્ડ ન્યુટ્રલ ફોર્મેલિનમાં ફિક્સ કરવામાં આવે ત્યારે જ સાચવવામાં આવ્યું હતું. મજબૂત એસિડિક બૌઇન ફિક્સેટિવ અથવા અનબફર્ડ, ફોર્મિક એસિડ ધરાવતા ફોર્મેલિનના ઉપયોગથી ડીએનએનું નોંધપાત્ર નુકસાન થયું. બાકીનો અપૂર્ણાંક ખૂબ જ ખંડિત છે.
ડાબી બાજુ, ટુકડાઓની લંબાઈ કિલોબેઝ જોડીઓ (kbp) માં દર્શાવવામાં આવે છે.

આકૃતિ 2 | ન્યુક્લિક એસિડ લક્ષ્યોની અખંડિતતાનું નુકસાન
(a) બંને સેર પર 3′-5′ ગેપના પરિણામે લક્ષ્ય DNA માં ભંગાણ થશે. DNA નું સંશ્લેષણ હજુ પણ નાના ટુકડા પર થશે. જો કે, જો DNA ટુકડા પર પ્રાઈમર એનિલિંગ સાઇટ ખૂટે છે, તો ફક્ત રેખીય એમ્પ્લીફિકેશન થાય છે. સૌથી અનુકૂળ કિસ્સામાં, ટુકડાઓ એકબીજાને ફરીથી સંતૃપ્ત કરી શકે છે, પરંતુ ઉપજ નાની અને શોધ સ્તરથી નીચે હશે.
(b) મુખ્યત્વે ડિપ્યુરિનેશન અને થાઇમિડાઇન ડાયમર રચનાને કારણે પાયાના નુકસાનથી H-બોન્ડ્સની સંખ્યામાં ઘટાડો થાય છે અને Tm માં ઘટાડો થાય છે. લાંબા વોર્મિંગ તબક્કા દરમિયાન, પ્રાઇમર્સ મેટ્રિક્સ DNA માંથી ઓગળી જશે અને ઓછી કડક પરિસ્થિતિઓમાં પણ તેને ખોલશે નહીં.
(c) અડીને આવેલા થાઇમીન પાયા TT ડાયમર બનાવે છે.
મોલેક્યુલર ડાયગ્નોસ્ટિક્સમાં ઘણીવાર થતી બીજી એક સામાન્ય સમસ્યા એ છે કે ફિનોલ-ક્લોરોફોર્મ નિષ્કર્ષણની તુલનામાં લક્ષ્ય ન્યુક્લિક એસિડનું શ્રેષ્ઠ કરતાં ઓછું પ્રકાશન. આત્યંતિક કિસ્સાઓમાં, આ ખોટા નકારાત્મકતા સાથે સંકળાયેલ હોઈ શકે છે. કોષના ભંગારના ઉકાળેલા લિસિસ અથવા એન્ઝાઇમેટિક પાચન દ્વારા ઘણો સમય બચાવી શકાય છે, પરંતુ આ પદ્ધતિ ઘણીવાર અપૂરતા ન્યુક્લિક એસિડ પ્રકાશનને કારણે ઓછી પીસીઆર સંવેદનશીલતામાં પરિણમે છે.

એમ્પ્લીફિકેશન દરમિયાન પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિનો અવરોધ

સામાન્ય રીતે, સબઓપ્ટિમલ પીસીઆર પરિણામો તરફ દોરી જતા તમામ પરિબળોનું વર્ણન કરવા માટે નિષેધનો ઉપયોગ કન્ટેનર ખ્યાલ તરીકે થાય છે. સખત બાયોકેમિકલ અર્થમાં, નિષેધ એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિ સુધી મર્યાદિત છે, એટલે કે, તે ડીએનએ પોલિમરેઝ અથવા તેના કોફેક્ટર (દા.ત., ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝ માટે Mg2+) ની સક્રિય સાઇટ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા સબસ્ટ્રેટ-પ્રોડક્ટ રૂપાંતરણ ઘટાડે છે અથવા અટકાવે છે.
નમૂનામાં રહેલા ઘટકો અથવા રીએજન્ટ ધરાવતા વિવિધ બફર્સ અને અર્ક સીધા એન્ઝાઇમને અટકાવી શકે છે અથવા તેના સહ-પરિબળો (દા.ત. EDTA) ને ફસાવી શકે છે, જેનાથી પોલિમરેઝ નિષ્ક્રિય થઈ જાય છે અને બદલામાં PCR પરિણામોમાં ઘટાડો અથવા ખોટા નકારાત્મકતા આવે છે.
જોકે, પ્રતિક્રિયા ઘટકો અને લક્ષ્ય ધરાવતા ન્યુક્લિક એસિડ વચ્ચેની ઘણી ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને 'PCR અવરોધકો' તરીકે પણ નિયુક્ત કરવામાં આવે છે. એકવાર કોષની અખંડિતતા અલગતા દ્વારા વિક્ષેપિત થાય છે અને ન્યુક્લિક એસિડ મુક્ત થાય છે, ત્યારે નમૂના અને તેની આસપાસના દ્રાવણ અને ઘન તબક્કા વચ્ચે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા થઈ શકે છે. ઉદાહરણ તરીકે, 'સફાઈ કરનારા' બિન-સહસંયોજક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દ્વારા સિંગલ- અથવા ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ DNA ને બાંધી શકે છે અને PCR પ્રતિક્રિયા વાહિની સુધી પહોંચતા લક્ષ્યોની સંખ્યા ઘટાડીને અલગતા અને શુદ્ધિકરણમાં દખલ કરી શકે છે.
સામાન્ય રીતે, પીસીઆર અવરોધકો મોટાભાગના શરીરના પ્રવાહી અને ક્લિનિકલ ડાયગ્નોસ્ટિક પરીક્ષણો (પેશાબમાં યુરિયા, લોહીમાં હિમોગ્લોબિન અને હેપરિન), આહાર પૂરવણીઓ (કાર્બનિક ઘટકો, ગ્લાયકોજેન, ચરબી, Ca2+ આયનો) અને પર્યાવરણમાં રહેલા ઘટકો (ફિનોલ્સ, ભારે ધાતુઓ) માં હાજર હોય છે.

વધુ પ્રચલિત પીસીઆર અવરોધકો બેક્ટેરિયા અને યુકેરીયોટિક કોષો, બિન-લક્ષ્ય ડીએનએ, ટીશ્યુ મેટ્રિસિસના ડીએનએ-બંધનકર્તા મેક્રોમોલેક્યુલ્સ અને ગ્લોવ્સ અને પ્લાસ્ટિક જેવા પ્રયોગશાળા સાધનોમાં મળી શકે છે. નિષ્કર્ષણ દરમિયાન અથવા પછી ન્યુક્લિક એસિડનું શુદ્ધિકરણ એ પીસીઆર અવરોધકોને દૂર કરવા માટે પસંદગીની પદ્ધતિ છે.
આજે, વિવિધ સ્વચાલિત નિષ્કર્ષણ સાધનો ઘણા મેન્યુઅલ પ્રોટોકોલને બદલી શકે છે, પરંતુ લક્ષ્યોની 100% પુનઃપ્રાપ્તિ અને/અથવા શુદ્ધિકરણ ક્યારેય પ્રાપ્ત થયું નથી. શુદ્ધ ન્યુક્લિક એસિડમાં સંભવિત અવરોધકો હજુ પણ હાજર હોઈ શકે છે અથવા પહેલાથી જ અસર કરી ચૂક્યા હોઈ શકે છે. અવરોધકોની અસર ઘટાડવા માટે વિવિધ વ્યૂહરચનાઓ અસ્તિત્વમાં છે. યોગ્ય પોલિમરેઝની પસંદગી અવરોધક પ્રવૃત્તિ પર નોંધપાત્ર અસર કરી શકે છે. પીસીઆર અવરોધ ઘટાડવા માટેની અન્ય સાબિત પદ્ધતિઓ પોલિમરેઝ સાંદ્રતા વધારવી અથવા BSA જેવા ઉમેરણોનો ઉપયોગ કરવો છે.
આંતરિક પ્રક્રિયા ગુણવત્તા નિયંત્રણ (IPC) ના ઉપયોગ દ્વારા PCR પ્રતિક્રિયાઓનું નિષેધ દર્શાવી શકાય છે.
ન્યુક્લિક એસિડ આઇસોલેટમાંથી ઇથેનોલ, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, આઇસોપ્રોપેનોલ અને ફિનોલ જેવા નિષ્કર્ષણ કીટમાં રહેલા બધા રીએજન્ટ્સ અને અન્ય દ્રાવણોને સંપૂર્ણ ધોવાના પગલા દ્વારા દૂર કરવા માટે કાળજી લેવી આવશ્યક છે. તેમની સાંદ્રતાના આધારે, તેઓ PCR ને સક્રિય અથવા અવરોધિત કરી શકે છે.