પીસીઆર પ્રતિક્રિયાઓમાં દખલ પરિબળો

પીસીઆર પ્રતિક્રિયા દરમિયાન, કેટલાક દખલ પરિબળોનો વારંવાર સામનો કરવો પડે છે.
પીસીઆરની ખૂબ જ સંવેદનશીલતાને કારણે, દૂષણ એ પીસીઆર પરિણામોને અસર કરતી સૌથી મહત્વપૂર્ણ પરિબળોમાંનું એક માનવામાં આવે છે અને ખોટા હકારાત્મક પરિણામો લાવી શકે છે.
એટલા જ નિર્ણાયક એવા વિવિધ સ્રોતો છે જે ખોટા-નકારાત્મક પરિણામો તરફ દોરી જાય છે. જો પીસીઆર મિશ્રણના એક અથવા વધુ આવશ્યક ભાગો અથવા એમ્પ્લીફિકેશન પ્રતિક્રિયા પોતે અટકાવવામાં આવે છે અથવા દખલ કરવામાં આવે છે, તો ડાયગ્નોસ્ટિક એસે અવરોધાય છે. આ કાર્યક્ષમતામાં ઘટાડો અને ખોટા નકારાત્મક પરિણામો તરફ દોરી શકે છે.
અવરોધ ઉપરાંત, નમૂનાની તૈયારી પહેલાં શિપિંગ અને/અથવા સ્ટોરેજની સ્થિતિને કારણે લક્ષ્ય ન્યુક્લિક એસિડ અખંડિતતાનું નુકસાન થઈ શકે છે. ખાસ કરીને, temperatures ંચા તાપમાન અથવા અપૂરતા સંગ્રહથી કોષો અને ન્યુક્લિક એસિડ્સના નુકસાન થઈ શકે છે. સેલ અને ટીશ્યુ ફિક્સેશન અને પેરાફિન એમ્બેડિંગ એ ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટેશન અને સતત સમસ્યાના જાણીતા કારણો છે (આકૃતિ 1 અને 2 જુઓ). આ કિસ્સાઓમાં, શ્રેષ્ઠ અલગતા અને શુદ્ધિકરણ પણ મદદ કરશે નહીં.

આકૃતિ 1 | ડીએનએ અખંડિતતા પર સ્થિરતાની અસર
એગ્રોઝ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ દર્શાવે છે કે ops ટોપ્સીના પેરાફિન વિભાગોથી અલગ ડીએનએની ગુણવત્તા નોંધપાત્ર રીતે બદલાય છે. ફિક્સેશન પદ્ધતિના આધારે અર્કમાં વિવિધ સરેરાશ ટુકડા લંબાઈનો ડીએનએ હાજર હતો. મૂળ સ્થિર નમૂનાઓમાં અને બફર કરેલા તટસ્થ formal પચારિકમાં નક્કી કરવામાં આવે ત્યારે જ ડીએનએ સચવાયો હતો. મજબૂત એસિડિક બ્યુઇન ફિક્સેટિવ અથવા અનબફર, ફોર્મેટ એસિડ ધરાવતા formal પચારિકતાના ઉપયોગથી ડીએનએનું નોંધપાત્ર નુકસાન થયું. બાકીનો અપૂર્ણાંક ખૂબ જ ખંડિત છે.
ડાબી બાજુ, ટુકડાઓની લંબાઈ કિલોબેઝ જોડી (કેબીપી) માં વ્યક્ત થાય છે

આકૃતિ 2 | ન્યુક્લિક એસિડ લક્ષ્યોની અખંડિતતાનું નુકસાન
(એ) બંને સેર પર 3′-5 ′ અંતર લક્ષ્ય ડીએનએમાં વિરામ લાવશે. ડીએનએનું સંશ્લેષણ હજી પણ નાના ટુકડા પર થશે. જો કે, જો ડીએનએ ટુકડા પર પ્રાઇમર એનિલિંગ સાઇટ ખૂટે છે, તો ફક્ત રેખીય એમ્પ્લીફિકેશન થાય છે. સૌથી અનુકૂળ કિસ્સામાં, ટુકડાઓ એકબીજાને ફરીથી પસાર કરી શકે છે, પરંતુ ઉપજ ઓછી અને તપાસના સ્તરની નીચે હશે.
(બી) મુખ્યત્વે ડિપ્યુશન અને થાઇમીડિન ડાયમર રચનાને કારણે પાયાનો નુકસાન, એચ-બોન્ડ્સની સંખ્યામાં ઘટાડો અને ટીએમમાં ​​ઘટાડો તરફ દોરી જાય છે. વિસ્તરેલ વોર્મિંગ તબક્કા દરમિયાન, પ્રાઇમર્સ મેટ્રિક્સ ડીએનએથી ઓગળશે અને ઓછી કડક પરિસ્થિતિઓમાં પણ એનિલ કરશે નહીં.
(સી) અડીને થાઇમિન પાયા ટીટી ડાયમર બનાવે છે.
બીજી સામાન્ય સમસ્યા જે ઘણીવાર મોલેક્યુલર ડાયગ્નોસ્ટિક્સમાં થાય છે તે ફિનોલ-ક્લોરોફોર્મ નિષ્કર્ષણની તુલનામાં લક્ષ્ય ન્યુક્લિક એસિડ્સનું ઓછું-શ્રેષ્ઠ પ્રકાશન છે. આત્યંતિક કેસોમાં, આ ખોટા નકારાત્મક સાથે સંકળાયેલ હોઈ શકે છે. સેલ કાટમાળના ઉકળતા લિસીસ અથવા એન્ઝાઇમેટિક પાચન દ્વારા ઘણો સમય બચાવી શકાય છે, પરંતુ આ પદ્ધતિ ઘણીવાર અપૂરતી ન્યુક્લિક એસિડ પ્રકાશનને કારણે પીસીઆર સંવેદનશીલતામાં પરિણમે છે.

વિસ્તરણ દરમિયાન પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિનું અવરોધ

સામાન્ય રીતે, અવરોધનો ઉપયોગ કન્ટેનર ખ્યાલ તરીકે થાય છે તે બધા પરિબળોનું વર્ણન કરે છે જે સબઓપ્ટિમલ પીસીઆર પરિણામો તરફ દોરી જાય છે. સખત બાયોકેમિકલ અર્થમાં, અવરોધ એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિ સુધી મર્યાદિત છે, એટલે કે, તે ડીએનએ પોલિમરેઝ અથવા તેના કોફેક્ટરની સક્રિય સાઇટ (દા.ત., એમજી 2+) ની સક્રિય સાઇટ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા સબસ્ટ્રેટ-પ્રોડક્ટ રૂપાંતરને ઘટાડે છે અથવા અટકાવે છે.
નમૂના અથવા વિવિધ બફર્સ અને રીએજન્ટ્સ ધરાવતા અર્કના ઘટકો એન્ઝાઇમ સીધી અટકાવી શકે છે અથવા તેના કોફેક્ટર્સ (દા.ત. ઇડીટીએ) ને છીનવી શકે છે, ત્યાં પોલિમરેઝને નિષ્ક્રિય કરી શકે છે અને બદલામાં ઘટાડો અથવા ખોટા નકારાત્મક પીસીઆર પરિણામો તરફ દોરી જાય છે.
જો કે, પ્રતિક્રિયા ઘટકો અને લક્ષ્ય ધરાવતા ન્યુક્લિક એસિડ્સ વચ્ચેની ઘણી ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને 'પીસીઆર અવરોધકો' તરીકે પણ નિયુક્ત કરવામાં આવે છે. એકવાર કોષની અખંડિતતા અલગતા દ્વારા વિક્ષેપિત થાય છે અને ન્યુક્લિક એસિડ પ્રકાશિત થાય છે, નમૂના અને તેના આસપાસના સોલ્યુશન અને નક્કર તબક્કા વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા થઈ શકે છે. ઉદાહરણ તરીકે, 'સ્વેવેન્જર્સ' બિન-વૈશ્વિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા સિંગલ- અથવા ડબલ-સ્ટ્રેન્ડ ડીએનએને બાંધી શકે છે અને આખરે પીસીઆર પ્રતિક્રિયા જહાજ સુધી પહોંચતા લક્ષ્યોની સંખ્યાને ઘટાડીને અલગતા અને શુદ્ધિકરણમાં દખલ કરી શકે છે.
સામાન્ય રીતે, પીસીઆર અવરોધકો મોટાભાગના શરીરના પ્રવાહી અને ક્લિનિકલ ડાયગ્નોસ્ટિક પરીક્ષણો (રક્તમાં પેશાબ, હિમોગ્લોબિન અને હેપરિનમાં યુરિયા), આહાર પૂરવણીઓ (કાર્બનિક ઘટકો, ગ્લાયકોજેન, ચરબી, સીએ 2+ આયનો) અને પર્યાવરણમાંના ઘટકો (ફેનોલ્સ, હેવી મેટલ્સ) માટે હાજર હોય છે

વધુ પ્રચલિત પીસીઆર અવરોધકો બેક્ટેરિયા અને યુકેરિઓટિક કોષો, નોન-ટાર્ગેટ ડીએનએ, ડીએનએ-બંધનકર્તા મેક્રોમ્યુલેક્યુલ્સના પેશી મેટ્રિસ અને લેબોરેટરી સાધનો જેવા કે ગ્લોવ્સ અને પ્લાસ્ટિકમાં મળી શકે છે. નિષ્કર્ષણ દરમિયાન અથવા પછી ન્યુક્લિક એસિડ્સની શુદ્ધિકરણ એ પીસીઆર અવરોધકોને દૂર કરવા માટે પસંદ કરેલી પદ્ધતિ છે.
આજે, વિવિધ સ્વચાલિત નિષ્કર્ષણ ઉપકરણો ઘણા મેન્યુઅલ પ્રોટોકોલને બદલી શકે છે, પરંતુ 100% પુન recovery પ્રાપ્તિ અને/અથવા લક્ષ્યોની શુદ્ધિકરણ ક્યારેય પ્રાપ્ત થઈ નથી. સંભવિત અવરોધકો હજી પણ શુદ્ધિકરણ ન્યુક્લિક એસિડ્સમાં હાજર હોઈ શકે છે અથવા અસર થઈ શકે છે. અવરોધકોની અસરને ઘટાડવા માટે વિવિધ વ્યૂહરચનાઓ અસ્તિત્વમાં છે. યોગ્ય પોલિમરેઝની પસંદગી અવરોધક પ્રવૃત્તિ પર નોંધપાત્ર અસર કરી શકે છે. પીસીઆર અવરોધને ઘટાડવા માટેની અન્ય સાબિત પદ્ધતિઓ પોલિમરેઝની સાંદ્રતામાં વધારો કરી રહી છે અથવા બીએસએ જેવા એડિટિવ્સ લાગુ કરી રહી છે.
આંતરિક પ્રક્રિયા ગુણવત્તા નિયંત્રણ (આઈપીસી) ના ઉપયોગ દ્વારા પીસીઆર પ્રતિક્રિયાઓના અવરોધને દર્શાવી શકાય છે.
ઇથેનોલ, ઇડીટીએ, સીઇટીએબી, એલઆઈસીએલ, જીયુએસસીએન, એસડીએસ, આઇસોપ્રોપ ol નોલ અને ફેનોલ જેવા નિષ્કર્ષણ કીટમાંના તમામ રીએજન્ટ્સ અને અન્ય ઉકેલોને દૂર કરવા માટે કાળજી લેવી આવશ્યક છે. તેમની સાંદ્રતાના આધારે, તેઓ પીસીઆરને સક્રિય અથવા અટકાવી શકે છે.